Western Blot檢測
作者：admin 發(fā)表時間：2015-04-13
服務(wù)價格 服務(wù)編號 價格 周期 CWS083 ￥1898/目的蛋白·膜 2周 服務(wù)內(nèi)容 通過預(yù)實驗優(yōu)化實驗條件，摸索一抗稀釋度，選擇其中最佳的一個稀釋度進行正式實驗。 樣品要求 客戶需新鮮或正確保存的蛋白樣品，目的蛋白陽性表達樣品（有陽性表達的細胞或組織）， 檢測目的蛋白的一抗（或由康為世紀代購）。樣品要求為： ·裂解樣品總蛋白量>500ug/樣品?！ ぜ毎麡悠房偟鞍诐舛龋?mg/ml?！ そM織樣品總蛋白濃度 10-15mg/ml。 終產(chǎn)品 ·曝光結(jié)果（膠片和掃描圖）； ·完整實驗報告。 服務(wù)說明 ·建議提供目的蛋白陽性表達樣品（純蛋白或有陽性表達的細胞或組織）作為陽性對照。 ·每張膜可檢測1-8個樣品。 ·一抗需在正確條件下保存，避免污染及反復(fù)凍融?！ と缧杩禐槭兰o進行數(shù)據(jù)分析，請另詢價。 ★Western blot操作流程介紹 1. 蛋白質(zhì)抽提 (1) 組織樣品，取適合量的新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品（非常重要），加1ml 含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑或其它蛋白提取試劑，勻漿后抽提總蛋白或核、膜蛋白?！ ?2) 細胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細胞，用PBS清洗細胞，去PBS加0.1-1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑或其它蛋白提取試劑抽提總蛋白或核、膜蛋白?！ ?. 蛋白質(zhì)定量： BCA蛋白檢測試劑檢測蛋白的濃度。 3. 變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳（SDS-PAGE），用微量加樣槍準確加樣到相應(yīng)的加樣孔中，安裝電泳分離蛋白。 4. 蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜或PVDF膜上。按Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)移裝置說明組裝濾紙凝膠纖維素夾層，30mA恒流條件下，4℃轉(zhuǎn)移過夜?！ ?. 膜的封閉和抗體孵育 (1) 膜在5%BSA溶液中室溫孵育1小時以封閉膜上的非物異結(jié)合?！ ?2) 封閉過的膜加入一級抗體室溫孵育膜1.5h,抗體抗原結(jié)合?！ ?3) 加入HRP標記的二級抗體以結(jié)合一級抗體及HRP標記的抗生物素抗體以結(jié)合分子量 標準，室溫孵育膜1小時，加入HRP標記的GAPDH/b-actin抗體可以同時檢測 GAPDH/b-actin含量。 6. 結(jié)果檢測：化學(xué)發(fā)光法檢測，膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育，經(jīng)X光膠片曝光顯影。
